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篩選穩定細胞株的兩種方法

點擊次數:289 發布時間:2021-08-24
  篩選穩定細胞株的兩種方法:
  1.單克隆環法主要用于整合率低的轉染法以及獲得單克隆細胞株。單克隆環法具有工作量小的優點,只要把轉染體細胞按一定的細胞密度放入新的培養皿,用合適的藥物篩選并在培養皿中進行擴增,適合少量勞動力作業,其劣勢可能難以獲得高產率的穩定株。
  2.逆轉錄病毒的混合克隆技術篩選:
  此法可用于制備穩定混合細胞株,其優點在于能在短時間內得到穩定的胞株,且能在任何時候將細胞稀釋成新的培養皿,傾向于整合靠近轉錄始端的位點的基因,容易激活下游基因,但同時這些整合到轉錄活性基因的基因很容易導致整合部位基因的插入失效,影響到克隆的純度。高等株中存在非整合細胞,這種混合細胞內的細胞穩定結合,不會失去生長的優勢。
  細胞株的凍存步驟:
  取培養2~3天生長旺盛的細胞,用細胞培養液將細胞配成2×106~2×107/ml。在1ml細胞凍存管中加入0.5ml細胞懸液,0.4ml小牛血清和0.1ml二甲基亞砜(或甘油),混勻后密封。置4℃ 1小時,-20℃ 2小時,然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上過夜后浸入液氮中。
  細胞株的復蘇流程:
  復蘇時,從液氮中取出凍存管,立即置37℃水浴中融化細胞。將細胞直接加入10ml含15%小牛血清的RPMI-1640培養液中,置37℃ 5%CO2飽和水套式二氧化碳培養箱中培養。懸浮細胞待細胞全部沉降后小心吸去上清液,更換新鮮的上述培養液,繼續培養;帖壁細胞則培養2~3實驗。
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